Исследование мутационного статуса BCR-ABL гена методом прямого секвенирования по Сэнгеру

Исследование мутационного статуса BCR-ABL играет ключевую роль в индивидуализации терапии пациентов с хроническим миелолейким лейкозом (CML) и некоторыми формами острого лимфобластного лейкоза (ALL). При помощи метода прямого секвенирования по Сэнгеру проводится качественная оценка наличия мутаций в области BCR-ABL1, что помогает определить резистентность к тирозинкиназным ингибиторам (TKI) и выбрать наиболее эффективную тактику лечения. В этой статье мы разъясним назначение анализа, порядок подготовки, методику, интерпретацию результатов и ограничения теста.

Для чего необходим анализ

Анализ мутационного статуса BCR-ABL направлен на выявление мутаций в области BKR-ABL1, которые могут приводить к резистентности к лечению TKIs, таким как иматиниб, дасатиниб, нилотиниб, понатиниб и др. Наличие конкретной мутации может менять выбор препарата, поэтому точная идентификация мутаций существенно влияет на эффективность терапии и прогноз болезни. В клинике Медальянс данное исследование часто проводится в связке с клиническим мониторингом, что позволяет врачам оперативно корректировать схему лечения в ответ на динамику заболевания.

Для проведения BCR-ABL мутации секвенирования обычно используют образцы периферической крови или костного мозга. Важные моменты подготовки и сдачи анализа включают:

• Соблюдение стандартов заборa биоматериала: образец крови (или костного мозга) в пластиковые пробирки с антикоагулянтом EDTA.
• Избегать повреждений образца и минимизировать задержку между забором и обработкой в лаборатории.
• Минимизация факторов, которые могут повлиять качество ДНК: надлежащий транспорт образца, правильная маркировка и соблюдение температурного режима до анализа.
• Не требуется специальная подготовка пациента, такая как голод или отмена медикаментов, за исключением рекомендаций лечащего врача по конкретной клинике.

Результат теста зависит от качества образца и правильности выполнения методики. Если в образце обнаружены мутации, это отражается в итоговом протоколе как наличие измененного нуклеотидного substituции в области BCR-ABL1.

Метод прямого секвенирования по Сэнгеру включает несколько последовательных этапов. Ниже приведены общие принципы, которые используются в лабораторной практике:

• Извлечение ДНК из образца крови или костного мозга с последующим контролем качества и концентрации полученного материала.
• Амплификация участка гена BCR-ABL1, который включает зону каталитической домены и участки, где чаще всего возникают резистентные мутации. Это обеспечивает покрытие значимого пула вариаций.
• Секвенирование ампликонов методом Сэнгера. В ходе этого этапа определяется последовательность нуклеотидов по сравнению с референсной последовательностью.
• Интерпретация полученного чтения: поиск точек замены, вставок или делеций, соответствующих известным мутациям в BCR-ABL1, и формирование заключения по наличию или отсутствию мутантных вариантов в тестируемой области.

Важно отметить, что данный тест является качественным: он сообщает о наличии или отсутствии мутации в тестируемой области, а не о точной доли мутантной аллели в образце. Если мутация обнаружена, в заключении указывается конкретное изменение нуклеотидной последовательности и возможный функциональный эффект, в случае, если он известен на клиническом уровне. В некоторых случаях может потребоваться дополнительное тестирование другими методами для уточнения динамики резистентности или для детального количественного анализа.

Результат с положительной мутацией означает, что в области BCR-ABL1 обнаружено изменение нуклеотидной последовательности, которое может ассоциироваться с резистентностью к одному или нескольким TKIs. Выбор дальнейшей тактики зависит от идентифицированной мутации и клинической картины. В ряде случаев известно, что определенные мутации снижают эффективность конкретного ингибитора, и врач может рассмотреть переход на другой препарат или комбинацию терапии. При этом важна клиническая корреляция, так как не все мутации автоматически приводят к клинической резистентности у каждого пациента.

Результат без мутации означает, что в тестируемой области BCR-ABL1 мутации не выявлено на уровне чувствительности метода. Это не исключает наличие других механизмов резистентности, включая негенетические факторы или мутации за пределами покрытой области анализа. В любом случае врач будет оценивать результаты теста в контексте динамики болезни, ответов на предыдущие режимы терапии и других лабораторных данных.

Для BCR-ABL мутации секвенирования нормой считается отсутствие выявляемых изменений в области анализа во время теста. В заключении обычно указано: “мутация не обнаружена в области исследования” или “отсутствуют известные резистентные мутации.” Если же обнаруживается мутация, прописывается конкретное изменение нуклеотидной последовательности, его нотация по общепринятым стандартам и, по возможности, клинико-референсная значимость мутации.

Как и любой метод молекулярной диагностики, Сэнгер-секвенирование имеет свои ограничения. Ниже перечислены ключевые моменты, которые важно учитывать:

• Чувствительность метода: обычно секвенирование по Сэнгеру способно обнаружить мутации, если они составляют примерно 15–20% от общей ДНК образца. Мутантные клеточные клоны ниже этой доли могут быть пропущены, особенно на ранних стадиях резистентности.
• Полиморфизмы и естественные вариации: некоторые полиморфные изменения могут быть интерпретированы как мутации; для точной интерпретации врачи опираются на клиническую базу и общепринятые базы данных мутаций.
• Покрытие области анализа: тест фокусируется на конкретной области BCR-ABL1, в связи с чем мутации вне этой области не будут выявлены.
• Не даёт количественной оценки: тест сообщает наличие/отсутствие мутации, но не долю мутантной аллели в образце. При необходимости может быть проведено дополнительное количественное или следящее за клоновым составом тестирование.

После получения результатов теста обсудите с лечащим врачом следующие вопросы:

• Какая мутация обнаружена и как она влияет на выбор конкретного TKIs?
• Нужна ли дополнительная проверка для других участков гена или для количественного анализа резистентности?
• Какие альтернативы терапии существуют в связи с выявленной мутацией?
• Как результаты теста сочетаются с клиническими данными и другими лабораторными исследованиями?

• Можно ли сдать этот тест повторно через короткий промежуток времени? — Повторная процедура может быть необходима для мониторинга мутаций или для оценки клональной динамики, особенно в контексте изменений лечения. Время повторной сдачи определяется клинической ситуацией и рекомендациями врача.
• Что делать, если результаты теста противоречат клинической картине? — В таких случаях решение принимается в рамках консилиума и может потребовать дополнительной диагностики, включая альтернативные молекулярно-генетические методы.
• Как часто следует проходить мониторинг мутаций у пациентов на TKIs? — Частота мониторинга определяется индивидуально и зависит от динамики заболевания и стратегии терапии. Обсуждайте план с вашим врачом.

При выборе лаборатории для исследования мутационного статуса BCR-ABL обратите внимание на аккредитацию методик, наличие квалифицированного персонала и прозрачность протоколов. Современное секвенирование по Сэнгеру остается надежным методом для качественной оценки мутаций в целевых регионах, особенно в рамках клинического управления клональной болезнью. Если у вас есть вопросы по конкретной методике или по форме подготовки к анализу в клинике Медальянс, обратитесь к лечащему врачу или в лабораторию, где проводится тест.

Метод прямого секвенирования по Сэнгеру для исследования мутантного статуса BCR-ABL обеспечивает clinicians важную информацию о резистентности к TKIs и позволяет более точно подбирать терапию для пациентов с CML и ALL. Важно помнить, что отсутствие обнаруженной мутации в тестируемой области не исключает все возможности резистентности, и любые решения по лечению следует принимать на основе комплексной клинической картины и рекомендаций онколога. При необходимости, ваш лечащий специалист может дополнить исследование другими методами или выполнить повторное тестирование через определённый период времени, чтобы отслеживать возможные изменения в клональном составе.